Untersuchung der bakteriziden Wirkung eines Mittels

Nov 16, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18111 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der rasante Anstieg der Zahl von Bakterien, die gegen viele häufig verwendete antimikrobielle Wirkstoffe resistent sind, und ihre globale Ausbreitung sind weltweit zu einem großen Problem geworden. Insbesondere bei Parodontitis, bei der es sich um eine lokalisierte Infektion handelt, besteht ein wachsender Bedarf an Behandlungsmethoden, die nicht primär auf antimikrobiellen Wirkstoffen basieren, und die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) erregt zunehmend Aufmerksamkeit. In dieser Studie wurden die bakteriziden Wirkungen eines Freie-Elektronen-Lasers im mittleren Infrarotbereich (MIR-FEL) auf E. coli als Grundlagenstudie untersucht, um die Anwendbarkeit von MIR-FELs zu untersuchen, die aufgrund ihrer Wellenlängenabstimmbarkeit selektiv molekulare Schwingungen anregen können , zu aPDT. Die in dieser Studie zu untersuchenden optimalen Bestrahlungswellenlängen wurden aus dem Infrarotspektrum der Bakterien ermittelt, das mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie gewonnen wurde. Aus dem FT-IR-Spektrum wurden fünf Bestrahlungswellenlängen (6,62, 6,88, 7,14, 8,09 und 9,26 µm) ausgewählt, und wir fanden heraus, dass die bakteriziden Wirkungen bei einer Wellenlänge von 6,62 µm deutlich stärker waren als die bei den anderen Wellenlängen beobachteten. Bei dieser Wellenlänge, die der Amid-II-Bande entspricht, nahm die Überlebensrate der Bakterien mit zunehmender Bestrahlungszeit deutlich ab. Im Gegensatz dazu zeigte die Bestrahlung eines mit Neodym dotierten Yttrium-Aluminium-Granat-Lasers (Nd:YAG) bei 1,06 µm keine deutliche bakterizide Wirkung. Nach der MIR-FEL-Bestrahlung wurden keine morphologischen Veränderungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass ein bakterielles Organellenmolekül das Ziel der MIR-FEL-Bestrahlung sein könnte, das genaue Ziel wurde jedoch nicht identifiziert. Darüber hinaus betrug die durch die Laserbestrahlung im Kulturmedium induzierte Temperaturänderung ± 1,5 °C bei Raumtemperatur. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die bakterizide Wirkung von MIR-FEL auf photochemische Reaktionen mit Infrarotphotonen zurückzuführen ist, da E. coli normalerweise durch Erhitzen auf 75 °C für 1 Minute oder länger abgetötet wird.

Der am Noda Campus der Tokyo University of Science (TUS) installierte Infrarot-Freie-Elektronen-Laser (FEL-TUS) ist ein gepulster Hochleistungslaser. Das wichtigste FEL-TUS-Gerät ist ein Mittelinfrarot-FEL (MIR-FEL) mit einem Oszillationswellenlängenbereich im Bereich von 5–12 µm, der nahezu den gesamten molekularen Fingerabdruckbereich abdeckt1. Dieser Wellenlängenbereich entspricht den Grundschwingungsfrequenzen von Molekülen; Daher kann der MIR-FEL zur Untersuchung der photochemischen Eigenschaften einer Reihe von Substanzen, einschließlich Molekülen, organischen Materialien, Biomolekülen, biologischen Zellen usw., durch selektive Schwingungsanregung2 verwendet werden. Die große Momentanbandbreite von MIR-Pikosekundenoszillatoren ist besonders attraktiv, da sie den Einsatz leistungsstarker Fourier-Transformationstechniken (FT) ermöglicht, die die Last der präzisen Wellenlängenkalibrierung von der Quelle auf das Detektionssystem übertragen und gleichzeitig ein hervorragendes Signal-Rausch-Verhältnis bieten Eigenschaften und wellenlängenunabhängige spektrale Auflösung3,4.

Der FEL-TUS führt Strahlung, die durch die Beschleunigung von Elektronen mit nahezu Lichtgeschwindigkeit in einem Linearbeschleuniger erzeugt wird, in ein periodisches Magnetfeld ein und verstärkt die Strahlung dann durch die Wechselwirkung zwischen der Strahlung und einem Elektronenstrahl in einem Resonator, wodurch erzeugt wird ein Laserstrahl5. Das resultierende Laserlicht zeichnet sich durch (I) eine spezielle Pulsstruktur bestehend aus Makro- und Mikropulsen, (II) hohe Helligkeit, (III) eine variable Wellenlänge und (IV) perfekte lineare Polarisation aus. Darüber hinaus ermöglicht die große Wellenlängenabstimmbarkeit des FEL-TUS eine selektive molekulare Schwingungsanregung und stellt eine geeignete Lichtquelle für die Dissoziation von Molekülen durch Schwingungsleiterklettern dar6.

In der Zahnarztpraxis werden häufig Neodym-dotierte Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd:YAG-Laser) mit einer typischen Emissionslichtwellenlänge von 1064 nm und Erbium-dotierte (Er):YAG-Laser (2940 nm) zur Sterilisation bei der Wurzelbehandlung eingesetzt Kanaleingriffe und die Behandlung von Parodontalerkrankungen7,8,9. Chemische Desinfektion mit Natriumhypochloritlösung wird traditionell zur Wurzelkanalbehandlung eingesetzt10, und die Anwendung einer antibiotikahaltigen Salbe oder die mechanische Entfernung mit einem Scaler sind gängige Behandlungen für Parodontitis. In jüngster Zeit hat der Einsatz von Lasern zur Sterilisation Aufmerksamkeit erregt; Allerdings haben die für solche Eingriffe verwendeten Laser eine feste Wellenlänge und es stehen nur wenige geeignete Lichtquellen mit variablen Wellenlängen zur Verfügung. In den letzten Jahren wurde über die Sterilisation von Titandioxid-Implantatoberflächen durch UV-Laser und die Nahinfrarot-Sterilisation von COVID-19 berichtet11,12. Allerdings gab es seit 1998 nur wenige Berichte über die Sterilisationseffekte von MIR-FELs13,14, obwohl erwartet wurde, dass MIR-FELs im Jahr 2006 als neue medizinische Geräte eingeführt werden15.

Die Sterilisation ist für die Behandlung parodontaler Erkrankungen von entscheidender Bedeutung, und es wurden verschiedene Sterilisationsmethoden beschrieben16. Antimikrobielle Wirkstoffe sind die häufigste Art der medikamentösen Therapie. Allerdings stellen der rasche Anstieg der Prävalenz von Bakterien, die gegen viele häufig verwendete antimikrobielle Wirkstoffe resistent sind, und deren weltweite Ausbreitung weltweit ein großes Problem dar17. Darüber hinaus nimmt die Geschwindigkeit der Entwicklung antimikrobieller Wirkstoffe deutlich ab, insbesondere für die Behandlung von Parodontalerkrankungen, bei denen es zu lokalen Infektionen kommt, und es besteht ein wachsender Forschungsbedarf für Behandlungen mit unterschiedlichen Wirkmechanismen18,19,20.

In den letzten Jahren wurde die photodynamische Therapie (PDT) als alternative Behandlung für verschiedene Krebsarten entwickelt21. Einer der Hauptvorteile dieser Art der Behandlung besteht darin, dass sie keine schwerwiegenden Nebenwirkungen hat und daher häufig wiederholt werden kann22. Es wurde auch zur Photoinaktivierung gramnegativer/positiver Mikroorganismen zu Sterilisationszwecken verwendet, was als antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT)23,24 bezeichnet wird. Vor diesem Hintergrund wurde berichtet, dass aPDT zur Sterilisierung vieler Mikroorganismen nützlich ist, darunter sowohl orale Krankheitserreger als auch multiresistente Bakterien25,26,27,28. Im Allgemeinen erfordern aPDTs jedoch die Verwendung von exogenen oder endogenen Farbstoffen, und nur wenige Studien haben berichtet, dass sie auf die intramolekularen Bindungen bakterienspezifischer Organellen abzielen, ohne dass diese Farbstoffe erforderlich sind.

Viele der Bausteine ​​des Lebens reagieren besonders empfindlich auf Strahlung aus dem mittleren Infrarotbereich, und MIR-FELs sind in der Lage, selektiv molekulare Schwingungen anzuregen15,29,30. Wenn die MIR-FEL-Bestrahlung außerdem bakterizide Wirkungen hat, ohne dass ein Farbstoff erforderlich ist, was sich von der herkömmlichen aPDT-Technik unterscheiden würde, könnte es möglich sein, damit eine einfachere Desinfektionsmethode zu entwickeln. Daher haben wir in dieser Studie eine grundlegende Untersuchung der bakteriziden Wirkung der MIR-FEL-Bestrahlung auf Escherichia coli durchgeführt, mit dem Ziel, die Möglichkeit der Verwendung von MIR-FELs als neue aPDT-Geräte zur Kontrolle von Infektionskrankheiten zu untersuchen.

In dieser Studie wurde der Stamm E. coli HB-101 als einheimisches gramnegatives Bakterium verwendet. Die E. coli wurden in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI-Brühe; Beckton Dickinson Co., Sparks, MD, USA) mit 1,5 % Bacto-Agar (Beckton Dickinson) 24 Stunden lang aerob kultiviert.

Der MIR-FEL, der bei 5 Hz betrieben wurde, wurde mithilfe eines goldbeschichteten Spiegels vertikal reflektiert und mit einer BaF2-Linse (Pier-optics Co., Ltd., Gunma, Japan) fokussiert und der optische Pfad so angepasst Die gesamte Bakterienlösung wurde einer Bestrahlung unterzogen. Die Leistung des Lasers direkt vor der Probe betrug ~ 10 mJ/Puls. Um die optimalen MIR-FEL-Wellenlängen für die Untersuchung zu bestimmen, wurde das IR-Spektrum von E. coli, die auf einen Glasobjektträger aufgetragen und 15 Minuten lang luftgetrocknet wurden, mit einem herkömmlichen FT-IR-Spektrometer (JASCO FT/IR-6100, JASCO, Tokio, Japan). Die FT-IR-Messungen wurden mit der Technik der abgeschwächten Totalreflexion (ATR)31 mit den folgenden Messparametern durchgeführt: Anzahl der Scans: 64, Auflösung: 4 cm−1, Leistung: 5–8 mJ/Impuls und Messbereich: 4000 –800 cm−1 (2,5–12,5 µm).

Das mit einem bei 5 Hz betriebenen Nd:YAG-Laser LS-2137 2-DL (LOTIS II Co., Minsk, Weißrussland) erzeugte Licht wurde bei 1064 nm herausgefiltert, indem es durch einen Bandpassfilter geleitet und dann mithilfe eines Spiegels vertikal reflektiert wurde. Der Strahlengang wurde so eingestellt, dass die gesamte Bakterienlösung vom Bestrahlungsfeld abgedeckt wurde. Die Leistung des Lasers direkt vor der Probe betrug 10 mJ/Puls.

Eine Übernachtkultur der Bakterien (100 µl) mit einem Absorptionswert von 1,0 bei einer Wellenlänge von 600 nm wurde zentrifugiert und in 10 µl physiologischer Kochsalzlösung (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan) suspendiert. Die Bakteriensuspension wurde 5, 15 oder 30 Minuten lang mit einem der Laser bestrahlt. Die Kontrollproben wurden nicht bestrahlt, sondern für die gleiche Zeitspanne belassen wie die bestrahlten Proben. Nach der Bestrahlung wurde jede Probe seriell verdünnt und 0,1 ml der verdünnten Probe wurden auf BHI-Agarplatten ausgestrichen, die dann 24 Stunden lang aerob kultiviert wurden. Anschließend wurde die Anzahl der Kolonien gezählt und die Anzahl lebensfähiger Bakterien in koloniebildenden Einheiten/ml (KBE) berechnet. Das Überleben der Bakterienzellen wurde anhand der Anzahl lebensfähiger Bakterien durch Zählen der Anzahl der KBE nach der Bestrahlung der Zellen geschätzt. Um die antibakterielle Wirkung der Laserbestrahlung zu untersuchen, wurde die Überlebensrate als Verhältnis der Anzahl lebensfähiger Zellen in der bestrahlten Gruppe zu der in der Kontrollgruppe bestimmt.

E. coli-Proben, die bei jeder geplanten Wellenlänge mit einem MIR-FEL- oder Nd:YAG-Laser bestrahlt wurden, wurden 60 Minuten lang mit 1 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben zweimal mit 0,1 M Natriumkacodylatpuffer gewaschen und durch eine abgestufte Reihe wässriger Ethanollösungen (50, 70, 80, 90 und 100 %; Eintauchzeit pro Reihe: 15 Minuten) dehydriert, bevor sie an der Luft getrocknet wurden . Anschließend wurden die Proben mithilfe eines Ionensputtersystems (JFC-1300, AUTO FINE COATER, Japan Electron Optics Laboratory, Ltd., Tokio, Japan) mit einer dünnen Platinschicht beschichtet. Die morphologischen Veränderungen von Bakterienzellen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM: JCM-6000Plus, JEOL, Tokio, Japan) beobachtet.

Um den Einfluss der Laserbestrahlung (60-minütige kontinuierliche Bestrahlung) auf die Temperatur der Bakterien zu untersuchen, wurden die Proben während des Bestrahlungsvorgangs 60 Minuten lang kontinuierlich mit einer SC620-Wärmebildkamera (FLIR Systems Japan KK, Tokio, Japan) überwacht.

Statistische Analysen wurden mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Tukey-Test unter Verwendung der Software BellCurve für Excel (Ver. 3.21, Social Survey Research Information Co., Ltd., Tokio, Japan) durchgeführt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei P < 0,05 als signifikant angesehen.

Das FT-IR-Spektrum von E. coli im Wellenlängenbereich von 2,5–12,5 µm ist in Abb. 1 dargestellt. Im oben genannten Spektrum wurden mehrere deutliche Absorptionspeaks erkannt. Ein ziemlich breiter Peak war bei ~ 3,0 µm zu sehen, schmale scharfe und starke Peaks wurden bei 6,00 und 6,62 µm beobachtet, schwache Peaks waren bei 6,88 und 7,14 µm vorhanden und breite Peaks waren bei 8,09 und 9,26 µm zu sehen. Den IR-Spektren der NIST Chemistry Reference Database (NIST Chemistry WebBook)32 zufolge zeigt die Absorption von H2O im mittleren Infrarot in der kondensierten Phase einen einzelnen scharfen Peak bei etwa 1648 cm−1 (6,07 µm) und einen breiten Peak um 3360 cm−1 (2,98 µm). Dementsprechend konnten die Peaks bei ~ 3,0 und 6,00 µm (in Abb. 1 durch graue Dreiecke markiert) sicher H2O zugeordnet werden, obwohl es möglich ist, dass die 6,00-µm-Bande wie erwähnt mit der Amid-I-Bande von E. coli zusammenhängt später. Die anderen fünf Wellenlängen (markiert durch graue Pfeile) wurden als Bestrahlungswellenlängen für die aktuelle Studie ausgewählt. Die entsprechenden Schwingungszuordnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Messung des Infrarot-Absorptionsspektrums von E. coli mittels Infrarot-Absorptionsspektroskopie. Es sind mehrere deutliche Absorptionspeaks sichtbar. Ein ziemlich breiter Peak ist bei ~ 3,0 µm zu sehen, schmale scharfe und starke Peaks sind bei 6,00 und 6,62 µm zu beobachten, schwache Peaks sind bei 6,88 und 7,14 µm vorhanden und breite Peaks sind bei 8,09 und 9,26 µm zu sehen. Die Peaks bei ca. 3,0 und 6,00 µm (markiert durch graue Dreiecke) waren hauptsächlich mit H2O verbunden. Die fünf Wellenlängen (markiert durch graue Pfeile) wurden im aktuellen Experiment als Bestrahlungswellenlängen ausgewählt.

E. coli wurden nach MIR-FEL- oder ND:YAG-Laserbestrahlung kultiviert. Anschließend wurde die Anzahl der KBE in jeder Gruppe bestimmt und die relative Überlebensrate im Vergleich zur Kontrolle berechnet (Tabelle 2 und Abb. 2). Eine 15-minütige Bestrahlung mit dem MIR-FEL bei 6,62, 6,88, 7,14, 8,09 oder 9,26 µm reduzierte die Anzahl lebensfähiger Bakterienzellen erheblich (P < 0,01), was zu relativen Lebensfähigkeitswerten von 2,3 ± 1,6 %, 12,0 ± 1,1 % führte. , 23,2 ± 2,1 %, 18,7 ± 1,7 % bzw. 18,6 ± 0,5 %. Die bakterizide Fähigkeit des MIR-FEL war bei allen Wellenlängen deutlich größer als die des Nd:YAG-Lasers (relative Lebensfähigkeit: 43,3 ± 5,3 %, P < 0,01), was auf die bakterizide Wirksamkeit von MIR-Licht hinweist. Insbesondere waren die bakteriziden Wirkungen bei einer Wellenlänge von 6,62 µm deutlich stärker als bei anderen Wellenlängen (P < 0,01). Die MIR-FEL-Bestrahlung bei 6,62 µm reduzierte das Überleben der Bakterien zeitabhängig deutlich (Abb. 3).

Bakterizide Wirkung von FEL-Bestrahlung bei verschiedenen Wellenlängen auf E. coli. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Test durchgeführt. Sternchen (**P < 0,01) weisen auf signifikante Unterschiede zur nicht bestrahlten Gruppe oder zur 15-minütigen MIR-FEL-Bestrahlungsgruppe hin.

Zeitabhängige bakterizide Wirkung (Lebensfähigkeit) der MIR-FEL-Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 6,62 µm. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Test durchgeführt. Signifikante Unterschiede sind durch Sternchen gekennzeichnet (**P < 0,01).

Nach 15-minütiger Bestrahlung mit der entsprechenden Wellenlänge wurden die Bakterienzellen unter einem Rasterelektronenmikroskop untersucht. Im Vergleich zur nicht bestrahlten Gruppe war die Anzahl lebensfähiger Zellen verringert und es wurde eine Zellzerstörung nach MIR-FEL-Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 6,62 µm beobachtet. Nach der MIR-FEL-Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 6,88 µm wurden jedoch keine morphologischen Veränderungen beobachtet, und im Vergleich zur nicht bestrahlten Gruppe war die Anzahl der Zellen nach der Bestrahlung mit einer MIR-FEL-Wellenlänge von 7,14 µm nur geringfügig verringert. Die elektronenmikroskopischen Bilder der Bakterienzellen, die einer MIR-FEL-Bestrahlung bei 9,26 µm oder einer Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser ausgesetzt waren, waren vergleichbar mit denen, die in der nicht bestrahlten Gruppe erhalten wurden (Abb. 4).

Morphologie von E. coli-Zellen nach MIR-FEL-Bestrahlung oder ND:YAG-Laserbestrahlung. Gezeigt werden Bilder von E. coli, die mit einem Rasterelektronenmikroskop bei 10 kV aufgenommen wurden. (A1) Unbehandelte Gruppe (Kontrolle); (A2) 6,62-µm-MIR-FEL-Bestrahlungsgruppe; (A3) 6,88-µm-MIR-FEL-Bestrahlungsgruppe; (A4) 7,14-µm-FEL-Bestrahlungsgruppe; (B1) Kontrolle für die 9,26-µm-MIR-FEL-Bestrahlungsgruppe; (B2) 9,26-µm-MIR-FEL-Bestrahlungsgruppe; (C1) Kontrolle für die ND:YAG-Bestrahlungsgruppe; (C2) 15-minütige Nd:YAG-Laserbestrahlungsgruppe; Maßstabsbalken, 2 µm.

Die Messung der Temperatur der Bakterienproben während der MIR-FEL-Bestrahlung erfolgte mit einer SC620-Thermografiekamera. Die mittlere Temperatur der Proben blieb bei Raumtemperatur ± 0,12 °C (Abb. 5).

Durch MIR-FEL-Bestrahlung in Bakterienproben induzierte Temperaturänderungen.

In der klinischen Praxis werden verschiedene Sterilisationsmethoden eingesetzt. Von diesen werden in der Zahnarztpraxis gelegentlich Laser zur Abtötung oraler Krankheitserreger eingesetzt. Halbleiterlaser, insbesondere Nd:YAG-, Er:YAG- und CO2-Laser, sind die in der Zahnarztpraxis am häufigsten eingesetzten Laser7,8,9. Bei diesen Lasern wird als Medium ein Festkörper oder Gas zusammen mit Licht verwendet, das bei einer einzigen Wellenlänge schwingt. Die Schwingungsbereiche dieser Laser liegen bei ≤ 3 µm bzw. ≥ 10 µm; Laser, die Licht im MIR-Bereich emittieren, wurden jedoch noch nicht in die Praxis umgesetzt. Nach unserem besten Wissen wurden keine Berichte über die Sterilisation von Bakterien durch resonante Schwingungsanregung veröffentlicht, was wahrscheinlich auf das Fehlen intensiver, wellenlängenabstimmbarer Lichtquellen im Spektralbereich von Fingerabdrücken zurückzuführen ist. Eine hocheffiziente Bestrahlung, die durch Laserlichtbestrahlung mit einer Wellenlänge erreicht werden kann, die mit einer molekularen Bindung in Resonanz steht, soll Schäden in der Umgebung unterdrücken. Unsere Gruppe forscht im Dentalbereich und diese Studie war eine Pilotstudie, in der untersucht werden sollte, ob MIR-FELs zur Behandlung von Parodontalerkrankungen eingesetzt werden können. In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen von IR-Strahlung im Bereich von 6–10 µm auf E. coli mithilfe eines auf dem TUS Noda Campus installierten MIR-FEL untersucht.

Tabelle 1 listet die Schwingungszuordnung der Peaks auf, die im FT-IR-Spektrum von E. coli33,34,35,36 zu sehen sind. Der scharfe Peak um 6,00 µm entspricht der Amid I (C=O)-Bande34,35,36. Wie bereits erwähnt weist jedoch auch flüssiges Wasser einen intensiven Peak um 6,00 µm auf. Da der Wasserpeak um 2,5 µm stark auftritt, was auf das Vorhandensein von Wasser in der Probe hinweist, gehen wir davon aus, dass der Peak um 6,00 µm sowohl aus H2O als auch aus der Amid-I-Bande besteht. Der scharfe Peak um 6,62 µm entspricht der Amid-II-Bande (νC-N gekoppelt mit N-H-Biegung von Proteinen)34,35,36. Oberhalb von 7 mm überlappen sich die Absorptionsbanden und die einzelnen Peaks sind nicht getrennt, sodass es schwierig erscheint, sie einem einzelnen Schwingungsmodus zuzuordnen. Beispielsweise führten Caine et al.35 die Banden um 7 mm auf den antisymmetrischen C-H-Biegemodus (~ 1468 cm−1) und den symmetrischen COO– (~ 1400 cm−1) von Fettsäuren und Polysacchariden zurück. Andererseits wiesen Acebo et al.33 auf die Möglichkeit von Carbonat (1424–1414 cm−1) hin. Der breite Peak um 8,1 mm lässt sich dem antisymmetrischen PO2-Schwingungsmodus zuordnen, der von der Amid-III-Bande begleitet wird35. Der breite Peak um 9,3 mm ist ein Symbol für den symmetrischen PO2-Schwingungsmodus35. Unter diesen Wellenlängen führte die MIR-FEL-Bestrahlung bei 6,62 µm (Amid II) zu der stärksten Hemmung des Bakterienwachstums nach der Bestrahlung (Abb. 2). Zu den antimikrobiellen Wirkstoffen mit bakteriostatischer Wirkung gehören Makrolide und Tetracycline, deren Wirkungsmechanismus in der Hemmung der Proteinsynthese besteht37,38. Daher sind Proteine ​​innerhalb von Mikroorganismen wichtige Komponenten für deren Wachstum und Überleben. Daher ist es möglich, dass die MIR-FEL-Bestrahlung, die ähnliche Wirkungen zeigte, alle Proteine ​​innerhalb der Bakterien beeinflusste, was zu bakteriostatischen Effekten führte, indem sie die am Bakterienwachstum beteiligten Prozesse hemmte. Das bakterielle Ziel von MIR-FEL wurde in dieser Studie jedoch nicht identifiziert, und das genaue Ziel der MIR-FEL-Bestrahlung muss in Zukunft durch quantitative Analyse mittels FT-IR geklärt werden.

Die auf der O-H-Schwingungsanregung von Wassermolekülen basierende Sterilisation ähnelt vermutlich dem Sterilisationsmechanismus von Er:YAG-Lasern (λ = 2,95 μm), bei dem der Er:YAG-Laser die Wassermoleküle um das Bakterium herum verdampft (ablatiert). , und seine Kraft verursacht physischen Schaden an den umgebenden Molekülen. Rauf et al. berichteten, dass für die Sterilisation durch einen Er:YAG-Laser ein Energieniveau von 30 mJ/Impuls erforderlich ist39. Bei der konventionellen aPDT galt ursprünglich die Verwendung grüner LEDs als am wünschenswertesten, um die Anregung von Rose Bengal zu maximieren und die Menge an produziertem Singulett-Sauerstoff zu erhöhen40,41. Im Gegensatz zur Bestrahlung mit nahem Infrarot oder sichtbarem Licht ist der Mechanismus der Sterilisation durch Strahlung im mittleren Infrarot jedoch deutlich anders. Bei einer Wellenlänge von 6,62 µm trifft der MIR-FEL zustandsselektiv auf das Amid-II-Band (N–H), was nicht zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wie Singulettsauerstoff führt und theoretisch keinen oxidativen Schaden verursachen würde. Andererseits, wie in Abb. Wie aus den Abbildungen 2 und 4 hervorgeht, hatte der MIR-FEL eine bakterizide Wirkung auf E. coli, verursachte jedoch keine morphologischen Veränderungen bei den Bakterien. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die MIR-FEL-Bestrahlung die bakterielle Aktivität verringern kann, indem sie die Aminosäuresynthese durch ihre Auswirkungen auf intermolekulare Bindungen innerhalb bakterieller Organellen hemmt.

Obwohl verschiedene Arten der Lichtbestrahlung, einschließlich Laserbestrahlung, Thermotoxizität hervorrufen können, lag in der vorliegenden Studie die im Kulturmedium während des Bestrahlungsverfahrens hervorgerufene Temperaturänderung bei ± 0,12 °C (Abb. 5) und die bakterizide Wirkung dieser Temperaturen Änderungen können ignoriert werden. Dieser Befund deutet stark darauf hin, dass die bakterizide Wirkung von MIR-FELs eher von IR-Photonen als von Temperaturerhöhungen herrührt. Es wurde berichtet, dass die Induktion der Hitzeschockproteinexpression nach einer Temperaturverschiebung (von 30 auf 42 °C) für die Verbesserung der Hitzetötungsresistenz notwendig ist42. Obwohl in dieser Studie keine Hitzeschockanalyse von E. coli nach der Bestrahlung durchgeführt wurde, wurde nach der MIR-FEL-Bestrahlung nur eine geringe Temperaturverschiebung beobachtet, und es ist unwahrscheinlich, dass die Laserbestrahlung die thermische Abtötungsresistenz der Zielmikroorganismen erhöht; Daher können die nachteiligen Auswirkungen einer mehrmaligen Durchführung einer aPDT unbedeutend sein.

In der jüngsten parodontalen Forschung wurden pharmakologische Wirkstoffe, die auf die Immunantwort von Bakterien und Wirten einwirken, als adjuvante Behandlungen ausgewählt. Allerdings hat sich keines dieser antimikrobiellen Mittel als Goldstandard zur Behandlung parodontaler Erkrankungen etabliert43. Frühere Studien haben berichtet, dass subgingivale parodontale Bakterien in vitro eine Resistenz gegen therapeutische Konzentrationen von Antibiotika wie Amoxicillin, Clindamycin und Doxycyclin zeigten, die üblicherweise zur Behandlung von Parodontalerkrankungen eingesetzt werden44. Da es daher möglicherweise nicht möglich ist, Parodontitis durch die alleinige Ausrottung gramnegativer Bakterien wirksam zu behandeln, sind weitere Studien zur aPDT erforderlich. Bevor MIR-FEL jedoch zur Behandlung von Parodontalerkrankungen eingesetzt werden kann, müssen die Auswirkungen von MIR-FEL auf Biofilm und Porphyromonas gingivalis untersucht werden, die als die wichtigsten Faktoren bei der Behandlung von Parodontalerkrankungen gelten. Der Nahinfrarot-Nd:YAG-Laser (Mittenfrequenz: 1,064 µm) hat eine Eindringtiefe von 1–5 mm. Die Eindringtiefe des Er:YAG-Lasers (Mittenfrequenz: 2,94 µm), der eine geringere Eindringtiefe als sowohl der Nd:YAG-Laser als auch der MIR-FEL aufweist, beträgt 1 µm15. Ein typisches Ziel für aPDT in der Zahnheilkunde ist P. gingivalis, und die Größe dieses Mikroorganismus beträgt etwa 1 µm45. Daher ist die Ausrottung von P. gingivalis durch MIR-FEL-Bestrahlung sehr gut machbar und könnte klinische Anwendungen haben.

Andererseits gibt es trotz der Tatsache, dass aPDT mit MIR-FEL bei bestimmten Wellenlängen eine bakterizide Aktivität gegen E. coli zeigt, immer noch große praktische Probleme, wie etwa ihre Auswirkungen auf normale Zellen (Sicherheit), wenn sie in vivo bestrahlt werden und das Design der zugehörigen Bestrahlungsgeräte müssen geklärt werden, bevor sie im klinischen Umfeld eingesetzt werden können. aPDT könnte als adjuvante Therapie eine Rolle bei der Behandlung parodontaler Erkrankungen spielen, und ihre Kombination mit anderen parodontalen Therapien könnte zu einem signifikanten klinischen Erfolg beitragen27,28. Beispielsweise wurde aPDT mit blauem Licht verwendet, um endogene intrazelluläre Porphyrine anzuregen, wie sie beispielsweise in Propionibacterium Aknes, Helicobacter pylori und Staphylococcus aureus vorkommen46,47,48. Daher kann die aPDT durch MIR-FEL, bei der das Sterilisationsziel nicht mit Farbstoffen angefärbt werden muss, als einfache aPDT anwendbar sein, da im Gegensatz zur herkömmlichen aPDT erwartet werden kann, dass sie allein auf der Grundlage der Lichtbestrahlung antibakterielle Wirkungen hervorruft.

Zusammenfassend lassen die Ergebnisse der vorliegenden MIR-FEL-Experimente darauf schließen, dass solche Laser der Grundstein für eine neue aPDT werden könnten, die durch Bestrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge eine intermolekulare Spaltung induziert. Darüber hinaus kann eine aPDT bei wiederholten Infektionen durchgeführt werden und es besteht kaum eine Möglichkeit, eine bakterielle Resistenz zu induzieren, was bei wiederholter Anwendung antimikrobieller Medikamente nicht der Fall ist. Diese Möglichkeiten legen nahe, dass MIR-FEL in Zukunft in einem neuen Typ von aPDT eingesetzt werden könnte. Derzeit gibt es nicht viele Berichte über die bakterizide Wirkung der MIR-FEL-Bestrahlung, obwohl es sehr interessant ist, dass MIR-FEL-Bestrahlung bei bestimmten Wellenlängen bakterizide Wirkungen gegen E. coli hat. Es ist notwendig, die bakterizide Wirkung der MIR-FEL-Bestrahlung und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen. Allerdings ist die Größe solcher Geräte das gravierendste Problem, das die klinische Anwendung von MIR-FELs einschränkt. MIR-FELs bestehen aus einer Hochfrequenz-Elektronenkanone zur Erzeugung des Elektronenstrahls, einer Beschleunigerröhre zur Beschleunigung des Elektronenstrahls, einem Undulator zur Lichterzeugung durch Mäandern des Elektronenstrahls und einem optischen Resonator zur Verstärkung und Oszillation des Lichts. Insbesondere ist das Beschleunigungsrohr allein 3 m lang5, was es schwierig macht, es in einer Klinik nur zum Zweck der Sterilisation unterzubringen. Eine weitere Verbesserung des Systems würde seine klinische Anwendung unterstützen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Antimikrobielle photodynamische Therapie

Gehirn-Herz-Infusion

Erbiumdotierter Yttrium-Aluminium-Granat

Freie-Elektronen-Laser

Fourier-Transformations-Infrarot

Infrarot

Freier Elektronenlaser im mittleren Infrarotbereich

Mit Neodym dotierter Yttrium-Aluminium-Granat

Wissenschaftliche Universität Tokio

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Diese Studie wurde durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Grant-Nummer 18K09895, unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Toshizo Toyama und Jun Fujioka.

Abteilung für orale Mikrobiologie, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa, 238-8580, Japan

Toshizo Toyama, Jun Fujioka, Keitaro Inaba und Nobushiro Hamada

IR FEL Research Center, RIST, Tokyo University of Science, 2641 Yamazaki, Noda, Chiba, 278-8510, Japan

Toshizo Toyama, Jun Fujioka, Takayuki Imai, Koichi Tsukiyama und Fumihiko Yoshino

Abteilung für Geistespädagogik, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa, 238-8580, Japan

Kiyoko Watanabe

Department of Dental Education Liberal Arts/Dental Education Institute, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa, 238-8580, Japan

Ayaka Yoshida

Sakuma Dental Clinic, 15-1 Yashikinaka-Aza, Moriai, Fukushima, Fukushima, 906-8003, Japan

Takaaki Sakuma

Abteilung für Angewandte Physik, Fakultät für Naturwissenschaften, Tokyo University of Science, 6-3-1 Niijuku, Katsushika-ku, Tokio, 125-8585, Japan

Takashi Nakajima

Abteilung für Pharmakologie, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa, 238-8580, Japan

Fumihiko Yoshino

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TT, JF und KW konzipierten die Studie, gestalteten die Forschung, sammelten die Daten und verfassten den ersten Entwurf des Manuskripts; TT, JF, AY, TS, KI, TI und FY führten die Forschung durch und analysierten die Daten; und KW, TN, KT, NH und FY haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt und erklären sich damit einverstanden, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein und sicherzustellen, dass Fragen im Zusammenhang mit der Genauigkeit oder Integrität jedes Teils der Arbeit angemessen untersucht und gelöst werden.

Korrespondenz mit Fumihiko Yoshino.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Toyama, T., Fujioka, J., Watanabe, K. et al. Untersuchung der bakteriziden Wirkung eines Freie-Elektronen-Lasers im mittleren Infrarotbereich auf Escherichia coli. Sci Rep 12, 18111 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22949-9

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Eingegangen: 02. Juni 2022

Angenommen: 21. Oktober 2022

Veröffentlicht: 27. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22949-9

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