Zusammenhang zwischen der Partikelproduktion des humanen Papillomavirus und der Schwere der rezidivierenden respiratorischen Papillomatose

Nov 21, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 5514 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die rezidivierende respiratorische Papillomatose (RRP) weist ein breites Spektrum an Schweregraden auf. Wir untersuchen den Zusammenhang zwischen der Partikelproduktion des humanen Papillomavirus (HPV) und dem Schweregrad der RRP. Von September 2005 bis Juni 2021 wurden 68 RRP-Proben (von 29 Patienten) eingeschlossen. Der HPV-Typ wurde bestimmt. Bewertet wurden die HPV-Viruslast, der körperliche Zustand sowie demografische und klinische Merkmale. Für p16, Ki-67, L1 und E4 wurde eine Immunhistochemie (IHC) durchgeführt. Zur Untersuchung der Proben verwendeten wir NanoSuit-CLEM (korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Die Gesamtzahl der Operationen bei HPV-positiven und HPV-negativen Fällen betrug 3,78 (n = 55/68, Bereich: 1–16) bzw. 1,30 (n = 13/68, Bereich: 1–3) (p = 0,02). ). IHC zeigte, dass L1 und E4 korrelierten und auf der Tumoroberfläche exprimiert wurden. NanoSuit-CLEM und TEM zeigten HPV-Partikel in L1-positiven Kernen. L1-IHC-positive Fälle hatten ein kürzeres Operationsintervall (p < 0,01) und häufigere Operationen (p = 0,04). P16-IHC, Viruslast und körperlicher Zustand waren nicht mit der Schwere der Erkrankung verbunden. Diese Studie visualisierte erstmals die Produktion von HPV-Partikeln in RRP. Eine anhaltende HPV-Partikelinfektion war mit dem Schweregrad verbunden. Wir empfehlen L1 IHC zur Beurteilung des RRP-Schweregrads zusätzlich zum Derkay-Score.

Rezidivierende respiratorische Papillomatose (RRP) ist ein gutartiger Tumor, der häufig durch das humane Papillomavirus (HPV) Typ 6 oder 111,2 verursacht wird. RRP wird auch als Larynxpapillomatose (LP)3 bezeichnet. Im Allgemeinen wird bei 80–96,9 % der Patienten über eine HPV-Beteiligung berichtet4,5,6; Einige Studien berichteten jedoch über eine niedrigere HPV-Erkennungsrate von etwa 60 %1,2. Darüber hinaus wurde in einigen Berichten die HPV-Beteiligung nicht untersucht7,8,9. Einige Patienten bleiben nach einer einzigen Operation in Remission, während andere nach mehreren Operationen eine maligne Transformation entwickeln und ungünstige Ergebnisse erzielen10,11. Der Derkay-Score, der den Schweregrad der Erkrankung anhand klinischer Befunde bewertet, wird häufig zur Bestimmung des Schweregrads von RRP12 verwendet. Es wurden jedoch nur wenige Studien durchgeführt, um den klinischen Schweregrad der Erkrankung anhand ihrer Pathogenese, beispielsweise des HPV-Lebenszyklus, zu untersuchen. Da HPV-DNA in der Kehlkopfschleimhaut von Patienten in Remission nachgewiesen wird, wird angenommen, dass eine persistierende HPV-Infektion an der Pathogenese von RRP13 beteiligt ist. Allerdings wurde in keinem Bericht der Zusammenhang zwischen der HPV-Beteiligung (oder dem Zustand der von Tumoren produzierten HPV-Partikel) und der Schwere der Erkrankung untersucht.

Die NanoSuit-Methode ist eine biomimetische Technik, die von der Fähigkeit inspiriert ist, lebende Drosophila-Larven mithilfe eines Feldemissions-Rasterelektronenmikroskops (FE-SEM) zu beobachten, das Hochvakuumbedingungen erfordert14,15. Die NanoSuit-CLEM-Methode (korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie), die die NanoSuit-Technologie anwendet, ist eine Technik, die eine Nanomembran auf pathologischen Geweben bildet und so den Wassergehalt des Gewebes und seine dreidimensionale Struktur während der Behandlung bewahrt unter optischer mikroskopischer Beobachtung wird mit einem REM16 beobachtet. Der Vorgang kann in wenigen Minuten abgeschlossen werden und die FE-SEM-Beobachtung kann problemlos durchgeführt werden. Wir haben zuvor verschiedene pathologische Gewebe wie den Magen-Darm-Trakt und die Speicheldrüse mit der NanoSuit-CLEM-Methode untersucht17,18,19. Darüber hinaus haben wir bereits über Standardmethoden zur Beobachtung verschiedener Viren wie Cytomegalievirus, Varizella-Zoster-Virus und HPV unter Verwendung der NanoSuit-CLEM-Methode20 berichtet.

Es wurde berichtet, dass die mRNA-Expression von HPV E4 und E5 einen hohen Anteil an RRP aufweist und möglicherweise an der Pathogenese der Krankheit beteiligt ist21,22. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die aktive Produktion von HPV-Partikeln mit der Schwere der RRP verbunden wäre, da E4 an der Bildung und Freisetzung von HPV-Partikeln beteiligt ist.

In dieser Studie haben wir versucht, den HPV-Lebenszyklus in RRP aufzuklären, indem wir HPV-Partikel mithilfe der NanoSuit-CLEM-Methode beobachteten. Darüber hinaus wollten wir zeigen, dass die aktive Produktion von HPV-Partikeln mit der Schwere der Erkrankung zusammenhängt.

Die Patientenmerkmale sind in Tabelle 1 zusammengefasst und detaillierte Daten sind in der Ergänzungstabelle S1 verfügbar. Wir führten eine direkte Sequenzierungsanalyse durch, um den HPV-Typ zu bestimmen (ergänzende Abbildung S1). Das Durchschnittsalter betrug 44,83 (Bereich: 30–69, SD: 8,67), 57,00 Jahre (Bereich: 45–69, SD: 12,53) und 60,10 (Bereich: 37–86, SD: 16,04) Jahre bei Patienten mit HPV-Typ 6, 11 bzw. negativ. Bei allen Fällen handelte es sich um UVP-Behandlungen für Erwachsene, und die Behandlung wurde im Operationssaal unter Vollnarkose durchgeführt. Keiner der Patienten erhielt eine HPV-Impfung. Patienten mit RRR waren größtenteils männlich (n = 25/29, 86,2 %), hatten eine Vorgeschichte des Rauchens (n ​​= 23/29, 79,3 %) und hatten eine Vorgeschichte von Alkoholkonsum (n = 24/29, 82,8 %). . Die Gesamtzahl der Operationen betrug 3,78 (n = 19/29, Bereich: 1–16) in HPV-positiven Fällen und 1,30 (n = 10/29, Bereich: 1–3) in HPV-negativen Fällen (p = 0,02). ). Darüber hinaus betrug der Derkay-Score 6,27 (n = 55/68, Bereich: 3–14) in HPV-positiven Fällen und 4,84 (n = 13/68, Bereich: 3–8) in HPV-negativen Fällen (p = 0,02). ). Für die HPV-Typen 6 und 11 wurden jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der Operationen und im Derkay-Score festgestellt (p = 0,10). Es wurden keine Fälle von disseminierten Läsionen im unteren Atemtrakt beobachtet. In drei Fällen kam es zu einer malignen Transformation, die alle HPV-negativ waren.

HPV-positive RRP-Fälle zeigten häufig Koilozytose auf der Tumoroberfläche (Bereich zwischen den gepunkteten Linien) (Abb. 1A). Auf der Oberfläche des Tumors, hauptsächlich in koilozytotischen Läsionen, war der Zellkern positiv für L1-Immunhistochemie (IHC), das Kapsidprotein von HPV, und die Zellmembran war positiv für E4-mRNA und -Protein, die an der Bildung von HPV-Partikeln beteiligt sind und loslassen (Abb. 1B–E). Sowohl L1 als auch E4 werden in einer ähnlichen Verteilung auf der Tumoroberfläche exprimiert, wobei einige Stellen beider positiv in derselben Zelle sind (Pfeil) (Abb. 1F). P16 IHC zeigte eine schwache Dispersion bei der Färbung (Abb. 1G). Die Ki-67-Färbung wurde hauptsächlich in der Basalschicht beobachtet, wobei der Prozentsatz positiver Zellen zur Tumoroberfläche hin abnahm (Abb. 1H).

Pathologische Befunde. (A) Auf der Tumoroberfläche (Bereich zwischen den gepunkteten Linien) ist eine koilozytotische Läsion mit nuklearer Atypie und perinukleären Vakuolen zu beobachten. (B,C) [(C) ist eine Vergrößerung des Quadrats in (B)]: HPV L1 IHC zeigt positive Zellen in koilozytotischen Läsionen der Tumoroberfläche (Pfeil). (D) RNA-in-situ-Hybridisierung der HPV E4-exprimierten Zellmembran in koilozytotischen Läsionen der Tumoroberfläche. (E) HPV E4 IHC und RNA-in-situ-Hybridisierung sind positiv für HPV E4 für dieselbe Läsion. (F) HPV L1 und HPV E4 werden in einer ähnlichen Verteilung auf der Tumoroberfläche exprimiert, wobei einige Stellen beider positiv in derselben Zelle sind (Pfeil). Braun steht für HPV L1 und Rot für HPV E4. (G) P16 IHC zeigt eine schwache Dispersion bei der Färbung. (H) Ki-67-IHC-Färbung wird hauptsächlich in der Basalschicht beobachtet, wobei der Prozentsatz positiver Zellen zur Tumoroberfläche hin abnimmt. Nur (C) wird bei einem 400-fachen Sichtfeld beobachtet, während die anderen bei einem 200-fachen Sichtfeld beobachtet werden. Balken zeigen 100 μm an. HPV Humanes Papillomavirus, IHC Immunhistochemie.

Wir verwendeten den immunreaktiven Score (IRS), um die p16-IHC-Färbung zu bewerten (ergänzende Abbildung S2). P16 IRS war in den HPV-positiven Fällen im Vergleich zu denen in den negativen Fällen statistisch signifikant (p < 0,01). Es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den HPV-Typen 6 und 11 (p = 0,62). (Abb. 2A). Der MIB-1-Index war in HPV-positiven Fällen signifikant höher als in HPV-negativen Fällen (p < 0,01). Es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den HPV-Typen 6 und 11 (p = 0,87) (Abb. 2B). Beim Vergleich von L1-IHC-positiven und -negativen Fällen war der MIB-1-Index in den positiven Fällen statistisch höher (p < 0,01) (Abb. 2C). Ebenso war E4 IHC in den HPV-positiven Fällen statistisch höher (p < 0,01) (Abb. 2D).

Quantitative Auswertung pathologischer Befunde. (A) Die P16-Färbung ist in HPV-positiven Fällen, HPV-Typ-6-positiven Fällen und HPV-Typ-11-positiven Fällen im Vergleich zu negativen Fällen statistisch signifikant (p < 0,01, p = 0,02 bzw. p = 0,02). (B) Der MIB-1-Index ist in HPV-positiven Fällen, HPV-Typ-6-positiven Fällen und HPV-Typ-11-positiven Fällen im Vergleich zu negativen Fällen statistisch signifikant (alle p < 0,01). (C) Der MIB-1-Index ist in HPV-L1-positiven Fällen signifikant höher als in negativen Fällen (p < 0,01). (D) Der MIB-1-Index ist in HPV E4-positiven Fällen statistisch signifikanter als in negativen Fällen (p < 0,01). * bedeutet p < 0,05 und ** bedeutet p < 0,01. HPV Humanes Papillomavirus.

Wir haben versucht, HPV-Partikel in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Schnitten zu identifizieren. Wir haben Fall 5–2 ausgewählt, der HPV Typ 11-positiv war und L1 IHC gut exprimierte. Zuerst führten wir L1 IHC durch und fotografierten die positiven Stellen (Abb. 3A). Anschließend wurden eine Inkubation mit 1 % Osmium und eine Osmium-Aufdampfung durchgeführt. Der Pfeilabschnitt des L1 IHC-positiven Kerns wurde mittels FE-SEM identifiziert (Abb. 3B). L1-positive Zellen wurden durch die Reaktion von Osmium mit 3–3′-Diaminobenzidin (DAB) verstärkt. Die Beobachtung des Kerns bei zunehmender Vergrößerung ergab das Vorhandensein zahlreicher Mikropartikel (Abb. 3C–G). Typische Partikel mit einer Größe von etwa 50–60 nm und derselben Größe wie die HPV-Partikel sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet (Abb. 3G).

HPV-Partikelnachweis in HPV-L1-positiven Zellen. (A) HPV L1 IHC wird durchgeführt und der Pfeil zeigt das Beobachtungsobjekt an. Zellkerne sind durch Pfeile gekennzeichnet. Es wird ein 400-faches Sichtfeld beobachtet. Der Balken zeigt 100 μm an. (B–G) HPV L1 IHC-positive Zellkerne werden mit der NanoSuit-CLEM-Methode beobachtet. Die Kerne sind mit den Mikropartikeln gefüllt. Typische Partikel mit einer Größe von ca. 50–60 nm und derselben Größe wie die HPV-Partikel sind durch Pfeilspitzen (G) gekennzeichnet. Das Sichtfeld der Bilder beträgt 500 × (B), 3000 × (C), 10.000 × (D), 30.000 × (E), 50.000 × (F) und 100.000 × (G). Die Balken zeigen 100 μm (B), 10 μm (C), 5,0 μm (D), 1,0 μm (E), 1,0 μm (F) und 500 nm (G). (H) HPV L1 IHC wird durchgeführt. Der Pfeil zeigt das Beobachtungsobjekt an. Das Sichtfeld beträgt 200 ×. Balken zeigen 100 μm an. (I, J) HPV L1 IHC-positive Zellkerne werden mit der NanoSuit-CLEM-Methode beobachtet. Die Kerne sind mit den Mikropartikeln gefüllt. Die Sichtfelder betragen 5000 × (I) und 30.000 × (J). Balken zeigen 10 μm (I) und 1,0 μm (J). (K–M) Die Bereiche werden mit der NanoSuit-CLEM-Methode unter Verwendung von TEM beobachtet. Im Zellkern werden Mikropartikel mit einer Größe von etwa 50–60 nm beobachtet und als HPV-Partikel identifiziert. Repräsentative HPV-Partikel sind mit Pfeilspitzen (M) gekennzeichnet. Die Vergrößerung beträgt 5000 × (K), 30.000 × (L) und 50.000 × (M). Die Balken zeigen 2,0 μm (K), 200 nm (L) und 200 nm (M). CLEM Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie, HPV Humanes Papillomavirus, IHC Immunhistochemie.

Als nächstes versuchten wir TEM-Beobachtungen der Mikropartikel im Kern mittels FE-SEM. Es wurde eine IHC für L1 durchgeführt (Abb. 3H), NanoSuit-Lösung II aufgetragen und die Probe mit FE-SEM untersucht. Die L1-positiven Zellkerne wurden mit Mikropartikeln gefüllt (Abb. 3I,J). Anschließend wurde das beobachtete Gewebe auf den Glasobjektträgern in Epoxidharz eingebettet und ultradünne Probenschnitte hergestellt und mittels TEM beobachtet. Die gleichen mit FE-SEM beobachteten Kerne wurden auch mit TEM beobachtet. In den Kernen L1-positiver Zellen wurden zahlreiche Mikropartikel von etwa 50–60 nm gefunden (Abb. 3K–M). Wir kamen daher zu dem Schluss, dass es sich bei den Partikeln in den L1-positiven Kernen um HPV-Partikel handelte.

Darüber hinaus haben wir versucht herauszufinden, ob HPV-Partikel bei jedem HPV-Typ unterschiedlich aussehen und wie die Partikel gebildet werden. In beiden HPV-Typ-6- und -11-positiven Fällen war L1-IHC unter Lichtmikroskopie in den oberflächlichen Schichten des Tumors stark positiv, und mithilfe von FE-SEM konnte festgestellt werden, dass diese Zellen im Zellkern mit Mikropartikeln gefüllt waren (Abb. 4A, B,G,H). In den etwas tieferen Schichten war L1 IHC in beiden HPV-Typ-6- und 11-positiven Fällen lichtmikroskopisch schwach positiv und die Partikelstrukturen im Zellkern waren zahlenmäßig reduziert und undeutlich (Abb. 4A, C, G, I). . Mittels Lichtmikroskop wurden keine L1-IHC-positiven Zellen in der Körner-, Dorn- und Basalschicht gefunden, und im Zellkern wurden keine Mikropartikelstrukturen beobachtet (Abb. 4A, D–G, J–L). Es wurden keine morphologischen Unterschiede in den Mikropartikeln zwischen den HPV-Typen 6 und 11 beobachtet. Im HPV-negativen Fall wurden mittels Lichtmikroskopie keine L1-IHC-positiven Zellen gefunden und es wurden keine Mikropartikelstrukturen in den Kernen beobachtet (Abb. 4M–R). .

Prozess der Bildung von HPV-Partikeln. (A–F) Der Prozess der Partikelbildung im Fall von HPV Typ 6. HPV L1 IHC wird durchgeführt und die Pfeile zeigen das Beobachtungsobjekt an. Es wird ein 200-faches Sichtfeld beobachtet. Der Balken zeigt 100 μm (A) an. In Bereichen, in denen HPV L1 IHC stark gefärbt ist (B), werden zahlreiche HPV-Partikel beobachtet, wohingegen in Bereichen, in denen HPV L1 IHC schwach gefärbt ist (C), die Anzahl der HPV-Partikel verringert ist und einige Partikel unreif zu sein scheinen. Bereiche, in denen HPV L1 IHC-negative Läsionen keine HPV-Partikel aufweisen (D–F). Bei 50.000-fachem Sichtfeld zeigt der weiße Balken 1,0 μm (B–F) an. (G–L) Der Prozess der Partikelbildung bei HPV-Typ-11-Fällen. HPV L1 IHC wird durchgeführt und die Pfeile zeigen das beobachtete Objekt an. Es wird ein 200-faches Sichtfeld beobachtet. Der schwarze Balken zeigt 100 μm (G) an. In Bereichen, in denen HPV L1 IHC stark gefärbt ist (H), werden zahlreiche HPV-Partikel beobachtet, wohingegen in Bereichen, in denen L1 schwach gefärbt ist (I), die Anzahl der HPV-Partikel verringert ist und einige Partikel unreif zu sein scheinen. Bereiche, in denen HPV L1 IHC-negative Läsionen keine HPV-Partikel aufweisen (J–L). Bei 50.000-fachem Sichtfeld zeigt der weiße Balken 1,0 μm (H–L) an. (M–R) HPV-negativer Fall. HPV L1 IHC wird durchgeführt und die Pfeile zeigen das beobachtete Objekt an. Es wird ein 200-faches Sichtfeld beobachtet. Der schwarze Balken zeigt 100 μm (M) an. Es werden keine HPV-Partikel beobachtet (N–R). Bei 50.000-fachem Sichtfeld zeigt der weiße Balken 1,0 μm (N–R) an. HPV Humanes Papillomavirus, IHC Immunhistochemie.

Als nächstes untersuchten wir den klinischen Schweregrad von L1-IHC-positiven Fällen, die durch eine aktive HPV-Partikelproduktion gekennzeichnet sind. In Abb. 5A zeigt die Farbe des Balkens den Zeitpunkt des chirurgischen Intervalls an und die Länge repräsentiert jedes chirurgische Intervall. Der Stern zeigt einen positiven L1-IHC an. Die Anzahl der L1-IHC-positiven Fälle war ungleichmäßig verteilt, die Anzahl der Operationen war hoch und das Operationsintervall kurz (Abb. 5A). Die Anzahl der Operationen war bei L1-IHC-positiven Patienten signifikant höher (p = 0,04) (Abb. 5B). Darüber hinaus war das Operationsintervall bei L1-IHC-positiven Patienten signifikant kürzer (p < 0,01) (Abb. 5C).

Zusammenhang zwischen L1 IHC und klinischem Schweregrad. (A) HPV L1 IHC ist in bestimmten Fällen positiv, mit einer hohen Anzahl von Operationen und kurzen Operationsintervallen. Die vertikale Achse gibt die Anzahl der Fälle und die horizontale Achse die Anzahl der Tage an. Die Farbe des Balkens gibt den Zeitpunkt des chirurgischen Intervalls an und die Länge repräsentiert jedes chirurgische Intervall. Sterne zeigen HPV L1 IHC-Positivität an. (B) Die Gesamtzahl der Operationen ist in L1-IHC-positiven Fällen deutlich höher (p = 0,04). (C) Das Intervall zwischen den Operationen ist in L1-IHC-positiven Fällen deutlich kürzer (p < 0,01). * Zeigt p < 0,05 an und ** zeigt p < 0,01 an. HPV Humanes Papillomavirus, IHC Immunhistochemie.

Als nächstes untersuchten wir die Viruslast und den körperlichen Zustand. Die HPV-Viruslast unterschied sich nicht zwischen den HPV-Typen 6 und 11 (p = 0,96) (Abb. 6A), und die Anzahl der HPV-Typ-11-Fälle war in E2/E6 signifikant niedriger (p < 0,01) (Abb. 6B). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass HPV-Typ 11 stärker integriert ist als Typ 6. Die HPV-Viruslast und E2/E6 zeigten keine Korrelation mit dem MIB-1-Index (r = 0,07, p = 0,66 und r = 0,12, p = 0,44) (Abb . 6C,D).

Beurteilung der HPV-Viruslast und des körperlichen Zustands. (A) Die Viruslast zeigt keinen Unterschied zwischen den HPV-Typen 6 und 11 (p = 0,96). (B) Die HPV-Typ-11-Werte sind in E2/E6 deutlich niedriger (p < 0,01). (C) Die Viruslast zeigt keine Korrelation mit dem MIB-1-Index (r = 0,07, p = 0,66). (D) E2/E6 zeigt keine Korrelation mit dem MIB-1-Index (r = 0,12, p = 0,44). **Zeigt p < 0,01 an. HPV Humanes Papillomavirus.

Wir haben auch die Korrelation zwischen dem Derkay-Score und IHC, der HPV-Viruslast, dem körperlichen Zustand und dem Operationsintervall bewertet. L1-IHC-Positivität wurde als 1 und negativ als 0 definiert. L1-IHC-Positivität war mit einem hohen Derkay-Score verbunden (Odds Ratio: 1,28, 95 %-Konfidenzintervall: 1,04–1,57, p = 0,02). Der MIB-1-Index und der Derkay-Score, ein Maß für den Schweregrad, zeigten eine schwache positive Korrelation (r = 0,23, p = 0,07) (Abb. 7A). Im Gegensatz dazu zeigten p16 IHC, ein Ersatzmarker für HPV bei Oropharynxkarzinomen, und Derkay-Scores eine schwache negative Korrelation (r = − 0,23, p = 0,06) (Abb. 7B). Da L1-IHC-Positivität und Derkay-Score miteinander verbunden waren, erwarteten wir, dass die HPV-Viruslast und E2/E6 mit dem Derkay-Score korrelierten; Es wurde jedoch keine Korrelation beobachtet (r = − 0,004, p = 0,976 bzw. r = 0,006, p = 0,966) (Abb. 7C, D).

Streudiagramme und Regressionslinien für den Derkay-Score. (A) MIB-1-Index und Derkay-Score zeigen eine schwache positive Korrelation (r = 0,23, p = 0,07). (B) P16-IHC- und Derkay-Scores zeigen eine schwache negative Korrelation (r = − 0,23, p = 0,06). (C) Viruslast und Derkay-Scores zeigen keine Korrelation (r = − 0,004, p = 0,976). (D) E2/E6- und Derkay-Scores zeigen keine Korrelation (r = 0,006, p = 0,966). (E) Es gibt keinen signifikanten Trend bei der mittleren Änderung des Derkay-Scores zu jedem Zeitpunkt der Operation. (F) Operationsintervall und Derkay-Score zeigen eine negative Korrelation (r = − 0,40, p = 0,01). IHC Immunhistochemie, DS Derkay-Score.

Bei der mittleren Änderung des Derkay-Scores zu jedem Zeitpunkt der Operation wurde kein signifikanter Trend beobachtet (Abb. 7E). Das Operationsintervall und der Derkay-Score zeigten eine negative Korrelation (r = − 0,40, p = 0,01) (Abb. 7F). Dies zeigt, dass das Operationsintervall ein nützlicher Indikator für den Schweregrad sein könnte.

HPV ist ein etwa 50–60 nm großes doppelsträngiges DNA-Virus ohne Hülle23. Da in der Remission HPV-DNA in der Kehlkopfschleimhaut nachgewiesen wird, wird angenommen, dass eine persistierende Infektion die Pathogenese von RRP13 ist. In dieser Studie zeigte IHC, dass L1, ein Kapsidprotein, und E4, das an der Bildung von HPV-Partikeln24,25 beteiligt ist, im RRP-Gewebe korrelierten. Darüber hinaus ergab die Beobachtung von L1-IHC-positiven Zellen durch NanoSuit-CLEM und TEM, dass die Kerne mit Mikropartikeln mit einer Größe von etwa 50–60 nm gefüllt waren, während bei L1-IHC-negativen Zellkernen keine ähnlichen Befunde beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass diese Partikel vorhanden waren HPV-Partikel. Darüber hinaus legt diese Studie nahe, dass HPV-Partikel beginnen, die Tumoroberflächenschicht zu bilden, und dass ihre Zahl zunimmt, wenn sie nach oben wandern. Diese Studie bewies zum ersten Mal, dass bei schwerem RRP kontinuierlich HPV-Partikel produziert werden, die zu einer anhaltenden Infektion führen können. Mit anderen Worten: Wir haben einen Teil des HPV-Lebenszyklus im RRP mit FFPE-Abschnitten erfolgreich visualisiert.

Diese Studie konzentrierte sich auch auf die HPV-Beteiligung. Berichten zufolge beträgt die HPV-Häufigkeit mehr als 80 %, basierend auf aktuellen Veröffentlichungen zu RRP4,5,6, aber einige Berichte zeigten eine HPV-Beteiligung von etwa 60 %1,2. Es liegen auch Berichte vor, in denen eine klinische Diagnose gestellt wurde, ohne zu prüfen, ob HPV beteiligt ist oder nicht7,8,9. Wir haben HPV mittels PCR, L1 IHC, E4 IHC und qPCR auf E2/E6 untersucht, die in HPV-negativen Fällen alle nicht nachweisbar sind. Diese Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein von HPV-negativen Fällen hin, selbst in pathologischen Fällen von Papillomen, die klinisch als RRP diagnostiziert wurden. Bei LP mit Beginn im Erwachsenenalter war die Altersgruppe der HPV-positiven Fälle niedriger. Genetische Mutationen bei RAS wurden in HPV-negativen Fällen berichtet26. Sie könnten älter sein, da eine genetische Mutation die primäre Ursache ist. Die vorliegenden Daten zeigten auch einen Trend hin zu höherem Alter bei HPV-negativem RRP. Andererseits unterschied sich das Alter der HPV-Typ-6- und 11-positiven RRP in vielen Berichten nicht; Daher könnte der signifikante Unterschied in dieser Studie auf die geringe Stichprobengröße zurückgeführt werden.

Aufgrund des breiten Spektrums an Schweregraden der RRP ist die Bestimmung des Schweregrads der Erkrankung von entscheidender Bedeutung. Der Derkay-Score ist ein weit verbreitetes Bewertungsinstrument. Eine Studie, in der 721 Patienten mit juvenilem RRP untersucht wurden, ergab, dass ein hoher Derkay-Score ein Risikofaktor für ein Wiederauftreten war27. Zwei Einschränkungen des Derkay-Scores bestehen jedoch darin, dass der Score den Ort des Wiederauftretens nicht vorhersagen kann und dass der Score von Bewerter zu Bewerter variieren kann, da keine klaren Kriterien für die Tumorgröße oder andere Faktoren existieren. Ein weiterer bekannter Risikofaktor ist die Beteiligung des HPV-Typs 1127,28,29. In dieser Studie unterschied sich die Anzahl der Operationen nicht zwischen den HPV-Typen 6 und 11; Es gab jedoch einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Patienten. Darüber hinaus stellten wir fest, dass bei L1-IHC-positiven Fällen das Operationsintervall kürzer und die Anzahl der Operationen höher war, was auf eine aktive Produktion von HPV-Partikeln hinweist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die anhaltende Produktion von HPV-Partikeln, die zu einer anhaltenden Infektion führt, die Hauptpathogenese von RRP ist. Es wurde berichtet, dass die Kombination aus Operation und HPV-Impfung das Risiko eines erneuten Auftretens verringert30,31. Diese Berichte stützen diese Hypothese. Die Zeit bis zur Diagnose könnte ein verwirrender Faktor sein. Betrachtet man jedoch die L1-IHC-positiven Fälle in dieser Studie, sind sie tendenziell positiv, unabhängig von den durchgeführten Operationen (Abb. 5A und Ergänzungstabelle S1, Fall 5, 8, 22, 23). Darüber hinaus kann es bei L1-IHC-Positivität auch zu kurzen Operationsintervallen kommen. Daher könnten Patientenfaktoren wie die Immunantwort relevanter sein als die Zeit. Darüber hinaus stellten wir fest, dass L1-IHC-Positivität mit einem hohen Derkay-Score verbunden war; Allerdings könnten der L1-IHC- und Derkay-Score unterschiedliche Aspekte bewerten. Der Derkay-Score wird ohne multiple Läsionen wahrscheinlich nicht als hoch angesehen und kann die Pathophysiologie einer persistierenden HPV-Infektion nicht beurteilen. Darüber hinaus ist L1 IHC nicht in der Lage, den gesamten Tumor zu beurteilen, da nur das Gewebe auf dem Objektträger beurteilt wird; Es zeigt jedoch starke Hinweise auf eine aktive HPV-Partikelproduktion. Somit könnten der Derkay-Score und die HPV-Partikelbildung verschiedene Aspekte des RRP bewerten. Im Gegensatz dazu wurde eine schwache negative Korrelation zwischen dem Derkay-Score und p16 IHC, einem bekannten Ersatzmarker für HPV32,33, beobachtet. Daher empfehlen wir, zusätzlich zum Derkay-Score einen L1-IHC-Test durchzuführen, um den RRP-Schweregrad genau beurteilen zu können.

Wir untersuchten auch die Viruslast und den körperlichen Zustand. Die Viruslast unterschied sich nicht zwischen den HPV-Typen 6 und 11, aber HPV-Typ 11 war dominant vom integrierten Typ. Im Gegensatz dazu korrelierten die Viruslast und der körperliche Zustand nicht mit dem MIB-1-Index. Darüber hinaus korrelierten die Viruslast und der körperliche Zustand nicht mit dem Derkay-Score. Frühere Berichte zeigten, dass die Viruslast mit jeder Operation schrittweise abnahm, bis eine Remission erreicht wurde34, während andere zeigten, dass die Viruslast und der körperliche Zustand nicht mit dem Tumorvolumen zusammenhängen22; Daher besteht kein Konsens. Die Viruslast schwankte innerhalb desselben Falles stark. Die Viruslast kann je nach Standort, an dem Proben entnommen werden, variieren. Da die Probenentnahme jedoch nicht für jeden Teilstandort separat durchgeführt wurde, konnten wir diesen Punkt nicht prüfen. Zur Klärung dieser Erkenntnisse sind weitere Untersuchungen erforderlich. Viruslast und körperlicher Zustand scheinen jedoch keine Indikatoren für den klinischen Schweregrad zu sein.

Wir identifizierten HPV-Partikel in FFPE-Schnitten und die Beobachtung von HPV-Partikeln war mit dem RRP-Schweregrad verbunden. Diese Studie hatte jedoch mehrere Einschränkungen. Die Anzahl der Fälle in dieser Studie war gering, obwohl 29 Fälle als relativ große Stichprobe für eine RRP-Studie angesehen werden können. In diese Studie wurden RRP mit jugendlichem Beginn, HPV-geimpfte Patienten und Läsionen der unteren Atemwege nicht einbezogen; Daher bleibt unklar, ob L1 IHC in solchen Fällen wirksam ist. Obwohl das Rezidivintervall anstelle des chirurgischen Intervalls ein besserer Indikator zu sein scheint, wurde in dieser Studie das chirurgische Intervall als Indikator verwendet, da die genaue Bestimmung des Rezidivzeitpunkts eine Herausforderung darstellte. Da das Operationsintervall jedoch mit dem Derkay-Score korreliert, kann es ein nützlicher Indikator für den Schweregrad sein. Alle Patienten mit maligner Transformation waren HPV-negativ. Ein Bericht aus Taiwan legt nahe, dass der HPV-negative Status ein Risikofaktor für eine maligne Transformation ist35. Obwohl der HPV-negative Status ein Risikofaktor für eine maligne Transformation sein könnte, haben wir diesen Punkt daher nicht im Detail untersucht.

Zusammenfassend ist es uns mit NanoSuit-CLEM und TEM erstmals gelungen, einen Teil des HPV-Lebenszyklus von RRP in FFPE-Schnitten zu visualisieren. Eine anhaltende Infektion mit HPV-Partikeln aufgrund der kontinuierlichen Produktion von HPV-Partikeln korreliert mit dem klinischen Schweregrad. L1 IHC ist zusätzlich zum Derkay-Score wichtig für die Beurteilung des Schweregrads der RRP.

Es wurden 68 RRP-Proben von 29 Patienten entnommen, die sich einer Operation an der Hamamatsu University School of Medicine, dem Seirei Hamamatsu General Hospital, dem Seirei Mikatahara General Hospital und dem Fujieda Municipal General Hospital unterzogen hatten. Die Proben wurden von September 2005 bis Juni 2021 entnommen. Bei allen Fällen wurde vor der Einbeziehung in die Studie pathologisch ein Papillom diagnostiziert. In allen Fällen wurde jeweils eine vollständige Tumorentfernung durchgeführt und die Fälle, in denen der Tumor verblieben war, wurden ausgeschlossen. Wann immer möglich, wurde die Operation innerhalb weniger Monate nach der Beobachtung eines Rezidivs durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board der Hamamatsu University School of Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: 19–222). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Medizinische Informationen, einschließlich Alter, Geschlecht, Alkoholexposition des Patienten, Raucherstatus, Derkay-Score und Datum der Operation, wurden aus den Patientenakten abgerufen.

Der Derkay-Score ist eine weit verbreitete Methode zur Beurteilung des Schweregrads. Die Formel des Derkay-Scores ist „die Summe der Punkte, die aus der Größe des Tumors an jeder Stelle berechnet werden“ plus „die Punkte, die aus den klinischen Befunden berechnet werden“. Die Beurteilung der Tumorgröße basiert auf dem Aerodigestivtrakt, der in 25 Unterbereiche unterteilt ist, von denen jeder eine Bewertung von 0 bis 3 erhält (0 = keine Läsion, 1 = Oberflächenläsion, 2 = erhabene Läsion und 3 = voluminöse Läsion). Die Beurteilung der klinischen Befunde basiert auf der Stimme des Patienten (0 = normal, 1 = abnormal und 2 = aphonisch), dem Stridor des Patienten (0 = abwesend, 1 = vorhanden mit Aktivität und 2 = vorhanden in Ruhe) und der Dringlichkeit des heutigen Eingriffs (0 = geplant, 1 = elektiv, 2 = dringend und 3 = dringend) und Grad der Atemnot (0 = keine, 1 = leicht, 2 = mäßig, 3 = schwer und 4 = extrem)12.

Gewebe zur DNA-Extraktion wurde aus dem Bereich mit dem größten Tumorvolumen entnommen. In Fällen, in denen die Gewebeprobenahme für diese Studie unzureichend war, wurde DNA aus FFPE-Gewebe extrahiert. Die DNA wurde mit einem QIAamp DNA Mini Kit oder QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Zum Nachweis von HPV wurde das Primer-Set TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set (Takara Bio, Kusatsu, Japan) verwendet. Proben, die durch PCR als HPV-positiv nachgewiesen wurden, wurden einer direkten Sequenzierungsanalyse mit einem 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) unterzogen. Der HPV-Typ wurde durch Suche nach Sequenzen mit BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) bestimmt.

Die Viruslast von HPV Typ 6 oder 11 und der physische Status wurden durch qPCR unter Verwendung des StepOne Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) bewertet. Es wurden Primer für HPV Typ 6 und 11 spezifisches E2 und E6 sowie Actin Beta entwickelt (Ergänzungstabelle S2). Standardkurven für E2, E6 und Aktin Beta wurden mithilfe eines Klonierungsplasmids wie zuvor beschrieben erstellt21,22,34. Als Viruslast wurde die E6-Kopienzahl pro Nanogramm DNA definiert. Das Verhältnis der E2-Kopienzahl/E6-Kopienzahl gibt den physischen Status von HPV an. E2/E6 < 1 zeigt an, dass sowohl integrierte als auch episomale (gemischte) Formen existieren, E2/E6 ≥ 1 zeigt an, dass die episomale Form vorherrscht, und E2/E6 = 0 zeigt nur eine integrierte Form an36.

Es wurden FFPE-Gewebeschnitte (4 μm dick) hergestellt. Die Antigengewinnung wurde mit der Epitope Retrieval Solution pH 9 (Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland) durchgeführt. Um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, wurden die Schnitte in einer 0,3 %igen H2O2-Lösung in Methanol inkubiert. Zum Blockieren der Schnitte wurde zehnprozentiges Ziegenserum (Nichirei Bioscience, Tokio, Japan) verwendet. Die verwendeten Primärantikörper waren HPV-L1-Antikörper (K1H8) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), p16 (E4H6) (Roche, Basel, Schweiz) und Ki-67 (MIB-1) (DAKO, Santa Clara). , CA, USA). Es wurden auch HPV-Typ-6-E4- und Typ-11-E4-Antikörper, wie zuvor beschrieben, verwendet21. Für sekundäre Antikörper wurde ein MAX-PO(M)- oder MAX-PO(R)-Kit (Nichirei Bioscience, Tokio, Japan) verwendet. Die Abschnitte wurden mit DAB visualisiert.

Die Doppelfärbung von L1 und E4 wurde von L1 durchgeführt und durch DAB sichtbar gemacht, und E4 wurde mit dem ImmPACT Vector Red AP Substrate Kit (Vector Laboratories, Newark, CA, USA) sichtbar gemacht.

Die IHC-Bewertungen wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen durchgeführt, die keinen Einblick in die Patienteninformationen hatten. IHC wurde als positiv oder negativ für L1 und E4 bewertet, der MIB-1-Index wurde als Prozentsatz der Ki-67-IHC-positiven Zellen/Gesamttumorzellen berechnet und p16 wurde als immunreaktiver Score (IRS) unter Verwendung der Färbeintensität als Prozentsatz berechnet der positiven Tumorzellen (Suppl. Abb. S2)37.

Es wurden HPV-Sonden vom Typ 6 E4 und Typ 11 E4 verwendet. Das Protokoll wurde bereits zuvor beschrieben21,22. Kurz gesagt wurden mit Digoxigenin markierte Sonden hergestellt und über Nacht bei 60 °C hybridisiert. Der Nachweis erfolgte mittels Nitroblautetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Lösung.

Es wurde eine IHC mit L1-Antikörper durchgeführt (DAB-gefärbt). Als nächstes wurden Bilder der mittels FE-SEM zu beobachtenden Bereiche aufgenommen. Die Objektträger wurden 5 Minuten lang mit 1%iger Osmiumlösung inkubiert. Osmium reagiert spezifisch mit DAB und wird bei Beobachtung mit FE-SEM38 verstärkt. Die Osmium-Dampfabscheidung wurde mit einem Osmium-Beschichter (HPC-1SW) (Vacuum Device, Mito, Japan) durchgeführt. Das Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Hitachi S-4800 (Hitachi, Tokio, Japan) wurde für FE-SEM-Beobachtungen verwendet und bei einer Beschleunigungsspannung von 5,0 kV betrieben. Die Bilder wurden im Yttrium-Aluminium-Granat-Rückstreuelektronenmodus (YAG-BSE) aufgenommen.

FFPE-Gewebeabschnitte. (8 μm dick) wurden aus unbeschichtetem Glas hergestellt. Die NanoSuit-Lösung II (Nisshin EM, Tokio, Japan) wurde auf die Objektträger aufgetragen, die mit einem Schleuderbeschichter mit 3000 U/min gedreht wurden, um einen Nanofilm zu erzeugen. Anschließend wurden FE-SEM-Beobachtungen durchgeführt. Die FFPE-Gewebeschnitte auf Objektträgerglas wurden mit 2 % Glutaraldehyd und 2 % Osmiumtetroxid erneut fixiert und in Epoxidharz (Nisshin EM, Tokio, Japan) eingebettet. Blöcke (0,5 mm2) wurden ausgeschnitten, um den FE-SEM-Beobachtungsbereich zu vereinheitlichen. Ultradünne Objektträger (60–80 nm) wurden hergestellt und mit Bleiacetat und Uranacetat gefärbt. JEM-1400 (JEOL, Tokio, Japan) wurde für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Beobachtungen verwendet.

Die Daten für die beiden Populationen in den beiden Kategorien wurden dem exakten Fisher-Test unterzogen. Der exakte Fisher-Test wurde mit zweiseitigen Tests durchgeführt. Die relevanten Daten umfassten Sex, Rauchen, Alkohol und maligne Transformation. Zum Vergleich der beiden Datensätze wurde der Welch-T-Test angewendet. Ein Welch-T-Test wurde mit zweiseitigen Tests durchgeführt. Zu den relevanten Daten gehörten Alter, Gesamtzahl der Operationen, Derkay-Score, IHC-Daten und Viruslast. Da diese Daten keine Homogenität der Varianz zeigten, wurde der Welch-T-Test durchgeführt. Der Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizient wurde verwendet, um die Stärke der linearen Beziehung zwischen den beiden Daten oder Zufallsvariablen zu bewerten. Zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen L1-IHC und dem Derkay-Score wurde eine binomiale logistische Regressionsanalyse angewendet. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt. Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 26 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) und KyPlot Version 6.0.2 (KyensLab, Tokio, Japan) durchgeführt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Die Autoren möchten Yoshiro Otsuki, Isao Ohta, Yuko Mohri und Hiromi Suzuki für ihre hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus danken wir dem Preeminent Medical Photonics Educations and Research Center der Hamamatsu University School of Medicine dafür, dass es uns die Nutzung seiner Geräte ermöglicht hat.

Diese Studie wurde durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 20K09689, 20K18249, 20K18250 und 20K18277) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie finanziert und ein HUSM-Stipendium.

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde/Kopf- und Halschirurgie, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handayama Higashi-ku, Hamamatsu, Shizuoka, 431-3192, Japan

Satoshi Yamada, Atsushi Imai, Daiki Mochizuki, Hiroshi Nakanishi, Ryuji Ishikawa, Junya Kita, Yuki Nakamura, Yoshinori Takizawa und Kiyoshi Misawa

Preeminent Medical Photonics Education and Research Center Institute for NanoSuit Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handayama Higashi-ku, Hamamatsu, Shizuoka, 431-3192, Japan

Satoshi Yamada, Toshiya Itoh, Takahiko Hariyama und Hideya Kawasaki

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Medizinische Fakultät der Universität Hamamatsu, Hamamatsu, Japan

Toshiya Itoh

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, Graduate School of Medicine, Universität Ryūkyū, Okinawa, Japan

Taro Ikegami & Mikio Suzuki

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Allgemeines Krankenhaus Seirei Hamamatsu, Hamamatsu, Japan

Jun Okamura

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Allgemeines Krankenhaus Seirei Mikatahara, Hamamatsu, Japan

Yoshihiro Noda

Abteilung für Regenerative und Infektionspathologie, Medizinische Fakultät der Universität Hamamatsu, Hamamatsu, Japan

Toshihide Iwashita und Hideya Kawasaki

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HK, KM und SY konzipierten die Studie und gestalteten die Experimente. SY, TI, TI, DM, RI, YT, JO und YN führten Experimente durch. SY, AI, HN, JK, YN, TI, TH, MS und KM führten eine Datenanalyse durch. Alle Autoren haben das Manuskript verfasst, die Entwürfe überprüft, die endgültige Fassung genehmigt und der Einreichung zugestimmt.

Korrespondenz mit Kiyoshi Misawa oder Hideya Kawasaki.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yamada, S., Itoh, T., Ikegami, T. et al. Zusammenhang zwischen der Partikelproduktion des humanen Papillomavirus und der Schwere der rezidivierenden respiratorischen Papillomatose. Sci Rep 13, 5514 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

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Eingegangen: 23. Januar 2023

Angenommen: 28. März 2023

Veröffentlicht: 06. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

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